Rolle der Mucin-Glykosylierung in der Darmmikrobiota

Oct 15, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13982 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Veränderungen in der Glykosylierung des intestinalen Mucins wurden mit einer erhöhten Darmpermeabilität und Empfindlichkeit gegenüber Entzündungen und Infektionen in Verbindung gebracht. Hier verwendeten wir Mäuse, denen von Core 3 abgeleitete O-Glykane (C3GnT–/–) fehlten, um die Auswirkung einer beeinträchtigten Mucin-Glykosylierung in der Darm-Hirn-Achse zu untersuchen. C3GnT−/−-Mäuse zeigten im Vergleich zu C3GnT+/+-Wurfgeschwistern veränderte mikrobielle Metaboliten im Blinddarm, die mit der Gehirnfunktion assoziiert sind, wie z. B. Dimethylglycin- und N-Acetyl-L-Tyrosin-Profile. Im Gehirn zeigten PSA-NCAM-positive Körnerzellen im Gyrus dentatus von C3GnT-/-Mäusen einen abweichenden Phänotyp. Damit einher ging ein Trend zu verringerten Expressionsniveaus von PSA sowie ZO-1 und Occludin im Vergleich zu C3GnT+/+. Verhaltensstudien zeigten eine Abnahme des Erkennungsgedächtnisses von C3GnT−/−-Mäusen im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen. Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Rolle der Mucin-O-Glykosylierung im Darm bei der potenziellen Beeinflussung der Gehirnfunktion, die durch die Passage mikrobieller Metaboliten durch eine beeinträchtigte Darmbarriere erleichtert werden könnte.

Der Magen-Darm-Trakt (GI) beherbergt eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft aus Bakterien, Archaeen und Eukarya, die zusammen als Darmmikrobiota bezeichnet werden und das Gleichgewicht zwischen Gesundheit und dem Auftreten von Darm- und extraintestinalen Erkrankungen beeinflussen1. In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass das Darmmikrobiom an der Signalübertragung zwischen Darm und Gehirn beteiligt ist, was zur Entstehung eines Konzepts der Darmmikrobiota-Hirn-Achse geführt hat2,3. Zunehmende präklinische Beweise deuten im Großen und Ganzen darauf hin, dass die Darmmikrobiota die Entwicklung, Funktion und das Verhalten des Gehirns über Immun-, Stoffwechsel- und neuronale Wege modulieren kann4. Bei einer Dysbiose sind diese Signalwege fehlreguliert und gehen mit einer veränderten Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und einer Neuroinflammation einher5.

Die Struktur und Funktion der Darmmikrobiota variiert entlang des Gastrointestinaltrakts, aber auch vom Lumen bis zur Schleimhaut6. Im Dickdarm ist der das Epithel bedeckende Schleim von entscheidender Bedeutung für die Darmhomöostase, da er eine mikrobielle Gemeinschaft in sicherer Entfernung von der Epitheloberfläche beherbergt7. Darmschleim-O-Glykane, die Hauptstrukturbestandteile des Schleims, stellen Bindungsstellen und eine nachhaltige Nährstoffquelle für die Bakterien dar, die in der Schleimnische leben8,9,10 und tragen so zur räumlichen Organisation der Darmmikrobiota bei11,12. Die Mucin-O-Glykosylierung wird durch die Addition eines N-Acetylgalactosamin (GalNAc)-Rests an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin eingeleitet, was zur Bildung des Tn-Antigens führt, das das Substrat für weitere Zuckeradditionen durch Glykosyltransferasen darstellt. Die Zugabe von Galaktose (Gal) zum Tn-Antigen führt zur Bildung von Kern 1 (Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr), während die Zugabe von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) zum Tn-Antigen zur Bildung von Kern 3 (GlcNAc-β1- 3GalNAcα-Ser/Thr)-Struktur. Die weitere Erweiterung von Kern 1 und Kern 3 mit GlcNAc-Resten durch die Wirkung von β1,6 N-Acetylglucosaminyltransferase führt zu Kern 2 (Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα1-Ser/Thr) und Kern 4 (GlcNAcβ1,6). (GlcNAcβ1,3)GalNAcαSer/Thr)-Strukturen13. Die Verteilung der Mucin-Kernstrukturen variiert entlang des Gastrointestinaltrakts, was teilweise auf die organspezifischen Expressionsmuster der Kern-Glycosyltransferasen zurückzuführen ist14. Die Strukturen von Core 1 und 2 sind typisch für Magen- und Zwölffingerdarmmucine, während Core 3 und Core 4 in den Mucinen des Dickdarms reichlich vorhanden sind14,15,16. Unter homöostatischen Bedingungen werden diese Mucin-Kernstrukturen durch die Zugabe von Monosacchariden weiter verlängert17 und die Mucin-Glykanketten werden normalerweise mit Sulfat-, Sialinsäure- oder Fucoseresten abgeschlossen, was zu äußerst vielfältigen Oligosaccharidstrukturen führt13,18,19.

Eine Veränderung der Mucin-O-Glykosylierung führt zu einer Störung der Wirt-Mikroben-Interaktionen und der Schleimhautimmunität, was zu einer beeinträchtigten Darmbarriere und damit verbundenen Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)11,20,21,22 beiträgt. Das Verständnis der Rolle der Mucin-Glykosylierung für Gesundheit und Krankheiten ist aufgrund der großen Vielfalt an O-Glykanstrukturen und enzymatischen Signalwegen, die die O-Glykosylierungsmaschinerie regulieren, eine Herausforderung23. In den letzten Jahren haben jedoch Glykosyltransferase-Knockout-Mäuse, die Defekte in der Glykosylierung aufwiesen, maßgeblich zum Nachweis der ursächlichen Rolle von O-Glykanen bei mehreren physiologischen Prozessen beigetragen. Mäuse, denen von Core 3 abgeleitete O-Glykane (C3GnT–/–) fehlen, zeigten eine erhöhte Anfälligkeit für chemisch induzierte Kolitis und Dickdarmkrebs, entwickelten sich jedoch im Gegensatz zu Mäusen, denen von Core 1 abgeleitete O-Glykane im Darm (IEC C1galt1–/–) fehlen, nicht spontane Kolitis20,24,25,26. Der Glykosylierungsdefekt in diesen Mausmodellen führte zu einer Verringerung des Muc2-Proteins und einer dünneren äußeren Schleimschicht, was aufgrund des direkten Kontakts der Darmmikrobiota mit der Epithelschicht zu einer erhöhten Darmpermeabilität und einer höheren Reaktionsfähigkeit auf Infektionen führte24. Während C1galt1 allgegenwärtig exprimiert wird, wird C3GnT am stärksten im proximalen Dickdarm exprimiert25. Interessanterweise bleibt die Anzahl der Becherzellen in diesen transgenen Tiermodellen unverändert, was darauf hindeutet, dass ein Mangel an Mucin-Glykosylierung ausreicht, um die Darmepithelbarriere zu stören26,27.

Ein „Leaky Gut“ kann zu den wichtigsten Signalwegen beitragen, die die Darmmikrobiota-Hirn-Achse vermitteln28. Eine geschwächte Darmbarriere ermöglicht ein umfassenderes Eingreifen des Immunsystems, schwächt aber auch die Eindämmung mikrobieller Produkte, die aus dem Darm in den Kreislauf gelangen können, was zu chronischen, leichten Entzündungen2 führt, die bei neurologischen Erkrankungen beobachtet werden29. Die Barrierefunktion des Darms wird durch mehrere Schutzschichten aufrechterhalten, darunter die Darmmikrobiota, die Schleimschicht sowie Epithel- und Immunzellen. Die Rolle der Mucin-Glykosylierung in der Darmmikrobiota-Hirn-Achse wurde jedoch nicht untersucht. Hier verwendeten wir C3GnT-/-Mäuse als Modell, um die Auswirkung einer veränderten Mucin-Glykosylierung im Darm auf die Gehirnfunktion und das neurologische Verhalten zu untersuchen.

Frühere Arbeiten zeigten, dass die Deletion des C3GnT-Gens (kodierend für Core-3-Beta1,3-N-Acetylglucoaminyltransferase, auch bekannt als B3GNT6 UDP-GlcNAc:betaGal Beta-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase 6) von Core 3 abgeleitete O-Glykane deutlich eliminierte reduzierte die gesamten intestinalen O-Glykane26 mit Muc2 von C3GnT-/−-Mäusen, die eine Mischung aus Glykanen vom Typ Core 1 oder Core 2 tragen13. Hier haben wir zunächst bestätigt, dass das C3GnT-Gen hauptsächlich im proximalen Dickdarm der C3GnT+/+-Mäuse exprimiert wurde, im Vergleich zu C3GnT-/--Mäusen, wobei im Gehirn beider Genotypen keine Expression festgestellt wurde (Abb. S1). Anschließend untersuchten wir den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Mucin-Glykosylierung und dem Darmmikrobiota-Profil bei C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Wurfgeschwistern. Das Glykosylierungsprofil gereinigter Mucine von Wurfgeschwistern wurde durch MALDI-TOF nach Freisetzung von Glykanen durch reduktive β-Eliminierung und Permethylierung analysiert. Die Analyse bestätigte, dass der Mangel an Core-3-O-abgeleiteten Glykanen die relative Häufigkeit der O-Glykan-Zusammensetzung in löslichen Mucinen des Dickdarms beeinflusste (Abb. 1). Die Häufigkeit der Glykane wurde dann als Verhältnis der Fläche jedes identifizierten Glykanpeaks zur Summe aller identifizierten Glykanpeaks pro Probe bestimmt. Insgesamt war der Prozentsatz sialylierter Glykane zwischen C3GnT−/−-Mäusen und C3GnT+/+-Mäusen ähnlich (71,1 % für C3GnT−/− vs. 69,2 % für C3GnT+/+), wohingegen ein deutlicher Rückgang der Häufigkeit fucosylierter Glykane beobachtet wurde die C3GnT−/− Mäuse (21,4 %) im Vergleich zu C3GnT+/+ Mäusen (49,7 %). In beiden Mäusegruppen war der Sulfatierungsprozentsatz niedrig (1,85 % für C3GnT+/+ und 2,98 % für C3GnT−/−). Die Fragmentierungsspektren von Glykanen zeigten auch veränderte Niveaus anderer Glykanstrukturen als Core 3 oder Core 4, da das Fehlen von Core 3 O-abgeleiteten Glykanen die weitere Synthese von Core 4-Glykanen verhinderte30. Beispielsweise wurde der Glykanpeak bei 1590 Da, der Glykanen entspricht, die aus einem Neu5Ac, drei N-Acetylhexosaminen und zwei Hexoseeinheiten bestehen, sowohl in C3GnT+/+ als auch in C3GnT−/− gefunden, es gab jedoch deutliche Unterschiede in den Fragmentierungsspektren, z B. das Vorhandensein des m/z 694-Peaks in der C3GnT+/+-Probe und des m/z 955- und 1314-Peaks in der C3GnT−/−-Probe, was auf Unterschiede in den Bindungen zwischen Monosacchariden dieser Glykanstrukturen hinweist (Abb. S2).

Relative Häufigkeit von Glykanen in löslichen Mucinen des Dickdarms. Diagramm, das die Häufigkeit von Glykanen unterschiedlicher Zusammensetzung in löslichen Mucinen von C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäusen zeigt.

Die Darmmikrobiota aus abgekratztem Dickdarmschleim (wird auch für das Mucin-Glykosylierungsprofil verwendet) und Stuhlproben von C3GnT-/-Mäusen und C3GnT+/+-Maus-Wurfgeschwistern wurden durch Sequenzierung der variablen 16S-rDNA-Region V3-V4 analysiert. Auf der Phylum-Ebene waren die dominanten Komponenten Mitglieder von Firmicutes/Bacillota und Bacteroidetes/Bacteroidota ohne größere Unterschiede in der Phyla zwischen C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäusen, weder in den Stuhlproben nach 21 (Zeitpunkt 1) noch nach 75 Tagen ( Zeitpunkt 2) nach der Geburt oder im abgekratzten Schleim (Abb. 2A). Es gab keine Hinweise auf einen Unterschied in der α-Diversität zwischen den Gruppen in Stuhlproben oder Schleim (beobachtete OTU-Zahlen, Shannon-Index und Simpson-Index). Die β-Diversität der Stuhl- und Schleimproben wurde sowohl unter Verwendung der Unifrac- als auch der Bray-Curtis-Distanz berechnet und die Ordinationen wurden aufgetragen, geschichtet nach Probenpunkt für jede Messung. PERMANOVA zeigte zu keinem Zeitpunkt der Probenahme Hinweise auf Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen den Gruppen (Abb. 2B). Beim Vergleich der Häufigkeiten auf Familienebene waren Lachnospiraceae und Lactobacillacea die dominantesten Familien im Schleim und im 75-Tage-Kotpellet von C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäusen (Abb. 2C). Im Durchschnitt über die Probenpunkte hinweg wurden 48 % der Messwerte bei C3GnT+/+-Mäusen Lachnospiraceae zugeschrieben, im Vergleich zu 38 % bei C3GnT–/–-Mäusen. Es gab einen entsprechenden Anstieg bei Lactobacillaceae bei C3GnT-/--Mäusen, wo die relative Häufigkeit 22 % betrug, gegenüber 14 % bei C3GnT+/+-Mäusen (Abb. 2C, Tabelle S1). Die Analyse mit Deseq2 lieferte einige Hinweise darauf, dass die relative Häufigkeit von Lactobacillaceae in 75-Tage-Kotproben im C3GnT–/– nach mehrfacher Testkorrektur höher war (log2-fache Änderung = 1,7; p = 0,004; q = 0,085), mit einem ähnlichen Ergebnis Ausmaß des in den Schleimproben beobachteten Unterschieds (log2-fache Änderung = 1,56; p = 0,027; q = 0,31). Allerdings waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant, wenn man alternative Ansätze für differenzielle Häufigkeiten verwendete, einschließlich linearer Regressionsanalyse relativer Häufigkeiten oder zentrierter Log-Verhältnisse.

Zusammensetzung der Darmmikrobiota aus abgekratztem Schleim und Stuhlproben von C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäusen. (A) Balkendiagramm der Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf Phylumebene aus abgekratztem Schleim zum Zeitpunkt 2 und Kotpellet zum Zeitpunkt 1 und 2 von C3GnT−/− (n = 12) und C3GnT+/+ (n = 15) Mäusen. (B) PCoA-Ordinationsdiagramm mit Bray-Curtis-Unähnlichkeit (C) Tabelle mit den am häufigsten vorkommenden Bakterienfamilien, gruppiert nach Genotyp (C3GnT−/− und C3GnT+/+) und ausgedrückt durch Prozentsätze im abgekratzten Schleim und Kotpellet zum Zeitpunkt 2.

Im Einklang mit früheren Ergebnissen zeigten wir bei Verwendung von FITC-Dextran, das per oraler Sondenernährung verabreicht wurde, einen Anstieg der Darmpermeabilität bei C3GnT-/- im Vergleich zu C3GnT+/+-Wurfgeschwistern, was die Rolle von Core-3-abgeleiteten O-Glykanen bei der Aufrechterhaltung der Schleimhautintegrität unterstützt26 (Abb. S3).

Um die Auswirkungen einer veränderten O-Glykosylierungs-Barrierefunktion des intestinalen Mucins auf die im Hippocampus auftretende neurale Plastizität zu bestimmen, konzentrierten wir uns auf den Phänotyp von Körnerzellen, die PSA-NCAM im Gyrus dentatus (DG) des C57BL/6-Wildtyps (WT) exprimieren ) und C3GnT−/− Mäuse. In jeder der beiden Gruppen wurden zwischen 4 und 7 Schnitte pro Maus (von – 1,58 mm rostral/dorsal bis – 2,54 mm kaudal/ventral Bregma-Position) analysiert (Abb. S4). Von der dorsalen bis zur ventralen Position des Hippocampus zeigten die PSA-NCAM-positiven (PSA-NCAM+) unreifen Körnerzellen, proliferierende Zellen, die die Neurogenese im DG31,32 unterstützen, bei den C3GnT−/− Mäusen einen abweichenden Phänotyp Kurze und unorganisierte Neuriten ragen in Richtung der oberen Molekülschicht, wohingegen die PSA-NCAM+-Zellen bei WT-Mäusen eine typische polarisierte Morphologie mit ausgedehnten apikalen Dendritenzweigen zeigten, die die obere Molekülschicht erreichten (Abb. 3A). Bei der Durchführung einer vergleichenden Zählung der PSA-NCAM+-Körnerzellen in der subgranulären Zone (SGZ) hatten die C3GnT-/−-Mäuse weniger positive Zellen pro Abschnitt (mittlerer Durchschnitt = 52,0, se = 8,0) im Vergleich zu WT-Mäusen (mittlerer Durchschnitt =). 76,4, se = 8,0), obwohl statistisch nicht signifikant (p = 0,09), wenn die weitere Analyse unter Verwendung eines linearen gemischten Modells mit Zufallseffekt der Maus durchgeführt wurde (Abb. 3B). Diese beobachtete Dysregulation von PSA-NCAM+-Körnerzellen im DG von C3GnT–/–-Mäusen stand jedoch im Einklang mit der Abnahme des Polysialinsäuregehalts in den Gehirnlysaten von C3GnT–/–-Mäusen im Vergleich zu C3GnT+/+-Wurfgeschwistern, wie durch bestimmt Immunblot (Abb. 3C) und durch Analyse der Bandenintensität quantifiziert (mit einem Mittelwert der Intensität von 11 für C3GnT–/– und 21 für C3GnT+/+) (Abb. 3D), wohingegen keine Veränderung der NCAM-Expressionsniveaus oder des Isoformenmusters beobachtet wurde (Abb. 3E).

Analyse von PSA-NCAM im Gehirn von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern. (A) Immunhistochemische Bilder, die den Phänotyp von PSA-NCAM+-Zellen im DG von C3GnT-/- und WT-Mäusen zeigen. Ein detaillierter Ausschnitt des dorsalen Teils des DG (rote gestrichelte Linie) zeigt den Phänotyp von Körnerzellen in C3GnT-/-Mäusen, die kürzere und desorganisierte Dendriten aufweisen, die von einem vergrößerten Zellsoma ausgehen (unten links), im Vergleich zu WT-Mäusen, bei denen die Dargestellt ist eine typische polarisierte Morphologie mit voll entwickelter Verzweigung ausgehend von Somazellen. (B) PSA-NCAM+-Zellen scheinen im DG von C3GnT-/- verringert zu sein, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant ist (p = 0,13). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. PSA-NCAM+-Zellen wurden in 4 bis 7 Objektträgern pro Tier gezählt. Bilder: Objektiv 10×, Maßstabsleiste: 100 µm. Für die Western-Blot-Analyse wurden die Lysate durch 4–12 % SDS-PAGE mit 50 µg Gesamtprotein pro Spur aufgetrennt. Western-Blot-Membran, die (C) die PSA-Expression im Hirnextrakt und (D) die Quantifizierung mit der ImageLab-Software zeigt. (E) Western-Blot-Membran, die das NCAM-Isoformmuster nach der Endosialidase-Behandlung zeigt. Als Kontrolle wurde GAPDH verwendet.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die Morphologie von PSA-NCAM+-Körnerzellen im DG von C3GnT-/−-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen desorganisiert und atypisch zu sein schien, untersuchten wir als Nächstes, wie dies mit dem Entwicklungsprozess, der synaptischen Plastizität und der Barrierepermeabilität im Zusammenhang stehen könnte Gehirn von C3GnT−/− und C3GnT+/+ Wurfgeschwistern. Die Genexpressionsanalyse wurde mittels RT-qPCR unter Verwendung validierter Primer gegen eine Gruppe von 14 Zielgenen und zwei Housekeeping-Genen (Gapdh, Tbp) durchgeführt. Die Genexpressionsunterschiede wurden für beide Housekeeping-Gene angepasst. Die interessierenden Gene wurden als Hinweis auf synaptische Plastizität, neurologische Entwicklung und Proliferation (BDNF, Creb1, NCAM1, Ki67), Polysialyltransferase-Aktivität (ST8sia2, ST8sia4), Bildung von Tight Junction und Cadherin (ZO-1, Cldn1, Ocln, Cdh2) ausgewählt ), Körnerzellreifung (GFAP, Prox1, NeuroD1) (Abb. S5). Eine fache Änderung der Expression für jedes Gen in C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Wurfgeschwistern wird mit 95 %-Konfidenzintervallen berichtet (Abb. 4). Es gab Hinweise darauf, dass C3GnT-/- eine Herunterregulierung des cAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb1, FC = 0,748, p-Wert = 0,04) und von Genen zeigte, die mit dem proliferativen Status von Körnerzellen assoziiert sind, wie z. B. Glia Fibrillary Acidic Protein (Gfap). , FC = 0,664, p-Wert = 0,015), obwohl die Signifikanz verloren ging, nachdem der p-Wert für die Multiplizität mithilfe der Benjamini- und Hochberg-Methode korrigiert wurde (Abb. 4). Die Western-Blot-Analyse zeigte einen Trend zur Verringerung der Expression der Tight-Junction-Proteine ​​ZO-1 (Abb. 5A) und Occludin (Abb. 5B) im Gehirn von C3GnT–/– im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen, obwohl die Quantifizierung nicht möglich war auf Proteinebene statistisch nicht signifikant.

Genexpressionsanalyse von Genzielen im Gehirn von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern. Die Analysen wurden mittels RT-PCR durchgeführt. Die Effektgröße ist die 2-te Potenz des Ct-Unterschieds zwischen den Genotypen, angepasst an den Ct der Housekeeping-Gene Gapdh und Tbp. Dies wird als fache Änderung der Expression zwischen den Genotypen interpretiert, wobei niedrige Werte auf eine höhere Expression im C3GnT+/+ hinweisen und hohe Werte auf eine höhere Expression im C3GnT−/− hinweisen. Fehlerbalken stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar.

Analyse von Tight-Junction-Proteinen im Gehirn von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern. Proteine ​​aus Gehirnlysaten wurden mithilfe einer 4–12 %igen SDS-PAGE mit 50 µg Gesamtprotein pro Spur aufgetrennt. Die Western-Blot-Analyse zeigte (A) ZO-1 und (B) Occludin. Die Quantifizierung wurde mit der ImageLab-Software durchgeführt. Als Kontrolle wurde GAPDH verwendet.

Um die Bandbreite der Metaboliten zu untersuchen, die von der veränderten Mucin-Glykosylierung betroffen sind, wurde eine ungezielte Metabolomik durchgeführt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die durchgeführt wurde, um eine vergleichende Gesamtansicht der Metabolomikdaten aus dem Gehirn und dem Blinddarminhalt zu erhalten, zeigte eine gewisse Trennung der C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Proben im Gehirn (Abb. S6A) und noch mehr deutliche Trennung von C3GnT−/−-Proben von C3GnT+/+-Proben im Blinddarminhalt (Abb. S6B). Primäre Analysen der Daten zeigten Unterschiede in den Metaboliten im Blinddarmgehalt von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Mäusen, wie beispielsweise von N-Acetyl-Lysin abgeleitete Metaboliten, Acetyl-Carnitine, Dimethylglycin und Acetyl-L-Tyrosin (Abb. 6). Die p-Werte wurden dann für eine Mehrfachtestkorrektur unter Verwendung der Benjamini-Hochberg-False-Discovery-Rate-Korrektur (FDR) angepasst und die Metaboliten nach signifikanten p-Werten von q < 0,05 geschichtet. Diese Analyse zeigte, dass sich die Konzentration von 13 Metaboliten zwischen den Genotypen unterscheidet und die signifikantesten durch vier Haupt-Superwege erzeugt werden, darunter Aminosäure- (n = 9), Cofaktor- und Vitamin- (n = 1), Lipid- (n = 2) und Xenobiotika-Metabolismus (n = 1) (Abb. S7).

Metaboliten im Blinddarm von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern. Die Diagramme zeigen die Verteilung der logarithmischen Konzentrationen einzelner Metaboliten, die bei q < 0,05 im Blinddarminhalt der beiden Mäusegruppen signifikant waren (die logarithmischen Konzentrationen sind auf den Mittelwert Null standardisiert).

C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäuse wurden drei verschiedenen Verhaltenstests unterzogen: dem Novel Object Recognition (NOR), der das Erkennungsgedächtnis testet, dem Y-Labyrinth zur Beurteilung des räumlichen Gedächtnisses und dem Open Field (OF), der psychomotorische Funktionen und Angst analysiert .

Der NOR-Test ist ein etablierter Verhaltenstest zur Bewertung von Gedächtnisveränderungen33, wie z. B. Arbeitsgedächtnis, Aufmerksamkeit, Angst und Präferenz für Neues34. Nach dem Gewöhnungs- und Gewöhnungsschritt mit zwei identischen Objekten wurden C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäuse einem neuen und einem vertrauten Objekt ausgesetzt. Wenn das Gedächtnis des Testsubjekts normal funktioniert, verbringt die Maus mehr Zeit damit, das neuartige Objekt zu erkunden, als die bekannten Objekte (Abb. S8A). Wenn die Erkundung aller Objekte gleich ist, deutet dieses Verhalten auf eine Gedächtnisstörung35 hin. Die Objekterkennung wurde anhand eines definierten Diskriminierungsindex bewertet, der auf der Grundlage der mit dem vertrauten und dem neuen Objekt verbrachten Zeit berechnet wurde. Hier zeigten C3GnT−/−-Mäuse im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen (Abb. 7A) eine signifikante Reduzierung der Zeit, die für die Erkundung des neuen Objekts aufgewendet wurde (p = 0,0183, zweiseitiger ungepaarter t-Test ± SEM), was darauf hindeutet Beeinträchtigung des Erkennungsgedächtnisses. Wie in der Heatmap (Abb. 7B) gezeigt, verbrachte C3GnT−/− weniger Zeit damit, das neuartige Objekt im Labyrinth zu erkunden, was auf eine schlechte Unterscheidung des neuartigen Objekts im Vergleich zum bekannten Objekt hinweist. Das Gegenteil wurde bei den C3GnT+/+-Mäusen beobachtet, die mehr Zeit mit dem neuartigen Objekt verbrachten und ein typisches Erkundungsverhalten zeigten.

Verhaltensaufgaben, die von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern ausgeführt werden. Neuartige Objekterkennung (NOR). (A) Der Diskriminierungsindex, berechnet als (TN − TF)/(TN + TF), wurde verwendet, um die Präferenz für das neue Objekt zu bewerten. Distanz und Geschwindigkeit der Aufgabe werden ebenfalls angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 8/Gruppe) *p < 0,05 dargestellt. (B) Die Heatmap-Visualisierung verfolgt die Zeit, die die Mäuse in der Nähe des neuartigen Objekts (schwarzer Pfeil) und des bekannten Objekts in der gegenüberliegenden Ecke verbracht haben. Rot steht für einen erhöhten Zeitaufwand und Blau für einen minimalen Zeitaufwand während des Tests. Y-Labyrinth (C) Streudiagramme, die die von beiden Mausgruppen zurückgelegte Distanz und Geschwindigkeit in den drei Armen des Y-Labyrinths zeigen. (D) Streudiagramm, das den spontanen Wechsel im Y-Labyrinth durch beide Mausgruppen zeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8/Gruppe) dargestellt. Offenes Feld (OF) (E) Die Heatmap-Visualisierung zeigt typische Beispiele für Erkundungsverhalten im Freilandtest in den Mausgruppen C3GnT−/− und C3GnT+/+. Rot steht für einen erhöhten Zeitaufwand und Blau für einen minimalen Zeitaufwand während des Tests. (F) Streudiagramme, die die gesamte in der Mitte der Box verbrachte Zeit, die auf freiem Feld zurückgelegte Distanz und die Geschwindigkeit während 5 Minuten zeigen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8/Gruppe) dargestellt.

Mit dem Y-Labyrinth können motorisch-kognitive Fähigkeiten und das Kurzzeitgedächtnis bei Mäusen beurteilt werden. Der spontane Wechsel in den drei Armen misst das räumliche Arbeitsgedächtnis der Mäuse. Ein hoher prozentualer Wechsel wird als hoher Anteil an Eintritten in aufeinanderfolgende Arme angesehen (Abb. S8B). Ein geringer prozentualer Wechsel (z. B. schlechtes Arbeitsgedächtnis) wird als höherer Anteil wiederholter Einträge in denselben Arm angesehen. Eine Maus mit einem guten Arbeitsgedächtnis merkt sich die Arme des Labyrinths, die sie bereits besucht hat, und erkundet den weniger kürzlich besuchten Arm. Dies erfordert eine Interaktion zwischen mehreren verschiedenen Regionen des Gehirns, wie dem Hippocampus und dem präfrontalen Kortex36. Hier wurde im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen kein signifikanter Unterschied in der von den C3GnT−/−-Mäusen zurückgelegten Distanz beobachtet, was auf das Fehlen signifikanter motorischer Beeinträchtigungen der Tiere hinweist (Abb. 7C). Allerdings zeigten C3GnT−/−-Mäuse im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen die Tendenz, weniger Zeit in den drei Armen des Labyrinths zu verbringen, was auf eine leichte Verschlechterung des räumlichen Gedächtnisses schließen lässt (Abb. 7D).

Der offene Feldtest ist ein gängiger Test zur Bewertung von angstähnlichem Verhalten in Tiermodellen: Er ermöglicht die Beurteilung der Erkundung neuer Umgebungen und der allgemeinen Bewegungsaktivität und bietet einen ersten Screen für angstbedingtes Verhalten bei Nagetieren37 (Abb. S8C). Nagetiere zeigen eine ausgeprägte Abneigung gegenüber großen, hellen, offenen und unbekannten Umgebungen. Im Freilandtest zeigen die Mäuse, wenn sie einem offenen Raum ausgesetzt sind, im Allgemeinen eine Thigmotaxis, das heißt die Tendenz, nahe an den Wänden des offenen Raums zu bleiben und erst später dessen Mitte zu erkunden38,39. Hier wurden bei den Freilandaufgaben keine Unterschiede zwischen C3GnT−/−- und C3GnT+/+-Mäusen festgestellt, wie in der Heatmap gezeigt, in der die von Mäusen beider Genotypen zurückgelegten Distanzen ähnlich zu sein schienen (Abb. 7E). Allerdings schienen C3GnT-/-Mäuse einen eher explorativen Phänotyp aufzuweisen, was durch eine erhöhte Geschwindigkeit und zurückgelegte Distanz in der Box angezeigt wird (Abb. 7F). Insgesamt deuten die Verhaltenstests auf eine beeinträchtigte Hippocampusfunktion im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen hin.

Glykane beeinflussen eine Vielzahl von Aspekten der Gewebeentwicklung und der Pathophysiologie, und Veränderungen in den Glykosylierungswegen tragen zum Auftreten und/oder Fortschreiten von Hirnfunktionsstörungen bei, von neurologischen Entwicklungsstörungen bis hin zu neurodegenerativen Störungen23,40. Es wurde gezeigt, dass Fehlregulationen der O-Glykosylierungswege vom Mucin-Typ in Tiermodellen zu einer Reihe von Auswirkungen führen, vom Tod des Embryos bis hin zu Entwicklungsstörungen und Krankheiten wie Kolitis und Krebs41. Von Core 3 abgeleitete O-Glykane spielen eine wichtige Rolle bei den Schutzfunktionen des Schleims im proximalen Dickdarm, wo sie stärker exprimiert werden25. Hier untersuchten wir die Auswirkung einer veränderten Mucin-Glykosylierung im Darm auf die Physiologie und das Verhalten des Gehirns.

Wir haben gezeigt, dass C3GnT-/-Mäuse weniger fucosylierte Glykane in Dickdarmmuzinen aufwiesen, was mit dem Mangel an Core-3-Glykanen vereinbar ist. Frühere Analysen zeigten einen Anstieg der Gesamtbakterien im Schleim im Vergleich zu Stuhlproben bei C3GnT-/-Mäusen und C1galt1-/-Mäusen (Mäuse mit Core-1-Mangel)26. Hier zeigten wir, dass die phylogene Zusammensetzung der mit Fäkalien und Schleim assoziierten Darmmikrobiota nach drei Wochen stabil war, wobei Firmicutes und Bacteroidetes die am häufigsten vorkommenden Phyla waren, während Deferribacteres/Deferribacterota, Actinobacteria/Actinobacteriota/Actinomycetota und Proteobacteria/Pseudomonadota weniger vertreten waren. Diese Ergebnisse stimmen mit der Dynamik der Darmmikrobiota bei Mäusen ohne spezifische Krankheitserreger (SPF) überein und zeigen, dass in einem frühen Lebensstadium (9 Tage nach der Entwöhnung) und in einem späten Stadium (141–150 Tage nach der Entwöhnung) der Kot Die Mikrobiota wird von Firmicutes und Bacteroidetes dominiert, mit einem geringen Beitrag von Actinobacteria, Proteobacteria und Verrucomicrobia/Verrucomicrobiota42. Es gab keine klaren Unterschiede in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota zwischen den Gruppen, abgesehen von einem Anstieg der relativen Häufigkeit von Lactobacillaceae bei C3GnT-/-Mäusen, der einer weiteren Bestätigung bedarf. Die erhöhte Darmpermeabilität bei C3GnT-/-Mäusen im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen kann die Passage von Signalen/Metaboliten von Darmmikroben zum Gehirn erleichtern, insbesondere von solchen, die von schleimassoziierten Mikroben stammen, die sich in unmittelbarer Nähe der darunter liegenden Schleimhaut befinden. Hier haben wir gezeigt, dass der Blinddarminhalt von C3GnT-/−-Mäusen veränderte Mengen an Metaboliten aufwies, die mit der Alzheimer-Krankheit (AD) und Depression in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise von N-Acetyl-Lysin abgeleitete Metaboliten, Acetyl-Carnitine, Dimethylglycin und Acetyl-L-Tyrosin43. 44,45,46.

Im Hippocampus wurde PSA-NCAM, exprimiert in zwei Arten von Körnerzellen, intermediären Vorläuferzellen und unreifen Körnerzellen, als Marker für proliferierende Neuronen verwendet. Granulatzellen präsentieren kein PSA-NCAM, wenn sie reif werden und in den oberen Nervenkreislauf gelangen47,48. Hier zeigten die unreifen PSA-NCAM+-Körnerzellen in der neurogenen Nische des Gehirns in den C3GnT-/−-Mäusen einen atypischen Phänotyp mit kurzen und desorganisierten Dendriten, die vom Zellsoma abgehen, und ein verändertes Verhältnis zwischen intermediären neuralen Vorläufer-/unreifen Körnerzellen. im Vergleich zu Kontrollmäusen, bei denen diese Zellen einen voll entwickelten Phänotyp und eine ausgewogene Verteilung der proliferierenden/differenzierenden Körnerzellen aufweisen49. Diese Beobachtung wurde durch eine verringerte Anzahl von PSA-NCAM+-Körnerzellen und eine Verringerung des Polysia-Gehalts im Gehirn von C3GnT-/-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen gestützt. Angesichts der Rolle von PSA-NCAM+-Körnerzellen im räumlichen Gedächtnis und im Unterscheidungsgedächtnis 50, 51 untersuchten wir als nächstes das Verhaltensmuster, das mit dem Gedächtnis und der Erkennung bei C3GnT-Wurfgeschwistern verbunden ist. Diese Analyse ergab eine signifikante Veränderung in der Fähigkeit von C3GnT–/–-Mäusen, neue und bekannte Objekte im Vergleich zu C3GnT+/+-Mäusen zu unterscheiden, was auf eine Beeinträchtigung der Gedächtnisschaltkreise des Hippocampus hindeutet, was mit der veränderten Expression von PSA-NCAM im DG von übereinstimmt C3GnT-/-Mäuse, obwohl auch eine Beteiligung des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) in Betracht gezogen werden kann, wie bereits berichtet52. Es hat sich gezeigt, dass der Abbau von PSA-NCAM aus dem DG das räumliche Lernen verringert und das Langzeitgedächtnis nichträumlicher Aufgaben bei Mäusen beeinträchtigt53. Darüber hinaus ist eine Beeinträchtigung der Körnerzellen im Hippocampus eng mit der Aufrechterhaltung des Gedächtnisses verbunden54, was sich auf die Erkennungsgedächtnisaufgabe bei Ratten auswirkt55. Bei Mäusen vor dem Absetzen wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie berichtet, dass transgenen Mäusen das St6Gal1-Gen fehlt, das für die β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase 1 kodiert, das Enzym, das für die Katalyse der Übertragung von Sialinsäure von CMP-Sialinsäure auf Galactose-haltige verantwortlich ist Substrate zeigten ein beeinträchtigtes räumliches und Erkennungsgedächtnis, eine Herunterregulierung des an der Bildung von PSA-NCAM beteiligten Signalwegs sowie eine Veränderung der Firmicutes-Zusammensetzung56 aufgrund der fehlenden 2,6-Sialylierung von Milch-Oligosacchariden. Unsere Daten belegen außerdem die Bedeutung der Glykosylierung des Wirts für die Kommunikation zwischen Darmmikrobiota und Gehirn.

Zusätzlich zur Regulierung von PSA-NCAM und der Veränderung der Kognition bei C3GnT-/-Mäusen beobachteten wir einen Trend zu einer verringerten Konzentration von ZO-1 und Occludin im Gehirn. Dies sind zwei wichtige Proteine, die an der Regulierung der Blut-Hirn-Schranke beteiligt sind57. Beispielsweise wurde in kultivierten Endothelzellen, die mit dem Amyloidpeptid Aβ1–4258 in Kontakt gebracht wurden, eine verringerte Expression von ZO-1 und Occludin sowie eine erhöhte BHS-Permeabilität beobachtet. In ähnlicher Weise war die Occludin- und ZO-1-Expression nach der experimentellen Induktion einer Gehirnembolie in isolierten Gehirnkapillaren von Ratten verringert59. Während die genauen Mechanismen, durch die Occludin und ZO-1 die BHS regulieren, noch untersucht werden, ist ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der selektiven Permeabilität der Barriere offensichtlich. Das Verständnis der Fehlregulation dieser Proteine ​​in C3GnT-/−-Mäusen kann wertvolle Einblicke in die Pathogenese verschiedener neurologischer Erkrankungen der Darm-Hirn-Achse liefern und möglicherweise zur Entwicklung neuer Therapiestrategien führen.

Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass eine veränderte Mucin-Glykosylierung im Dickdarm zu einer möglichen Modulation des Phänotyps unreifer Körnerzellen, die PSA-NCAM exprimieren, beitragen kann. Interessanterweise führte die Langzeitergänzung mit dem Darmsymbionten Akkermansia muciniphila im Mausmodell der frühen Alzheimer-Krankheit zu einer Reparatur der Darmbarriere-Dysfunktion und zu Verbesserungen der Kognition und des angstbezogenen Verhaltens, was auf eine Rolle einer beeinträchtigten Schleimbarriere bei der Veränderung hindeutet kommt im Hippocampus dieser Mäuse vor60. Unsere Verhaltensstudien bestätigten eine beeinträchtigte Funktion des Hippocampus bei den C3GnT−/−-Mäusen, was durch die Verschlechterung der Erkennung und des räumlichen Gedächtnisses gezeigt wurde. Es bedarf jedoch weiterer Arbeit, um die mikrobiellen Metaboliten zu lokalisieren, die die im Hippocampus von C3GnT−/ beobachteten physiologischen und funktionellen Veränderungen beeinflussen. − Mäuse.

Alle durchgeführten experimentellen Verfahren und Protokolle wurden vom Animal Welfare and Ethical Review Body (UEA AWERB) der University of East Anglia überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den Spezifikationen des United Kingdom Animal Scientific Procedures Act von 1986 (Amendment Regulations 2012) durchgeführt die Home-Office-Projektlizenz PP9417531. Die Berichterstattung über die Studienergebnisse entspricht den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)61.

Wir haben zunächst C57BL/6-Mäuse mit den C3GnT-/-Mäusen gezüchtet, um Mäuse zu erzeugen, die heterozygot für das Gen (C3GnT+/-) sind. Sobald die Jungtiere (F1) die Geschlechtsreife erreicht hatten (ca. 6 bis 8 Wochen alt), wurden Männchen und Weibchen C3GnT+/− gezüchtet, um die F2-Mäusekolonie zu erzeugen. Die F2-Würfe bestanden aus 25 % homozygoten Wildtyp-Mäusen (C3GnT+/+), 50 % heterozygoten C3GnT+/– und 25 % homozygoten Knock-out-Mäusen (C3GnT–/–). Nach dem Absetzen (im Alter von ca. 3 Wochen) wurden die Mäusewürfe durch Analyse der genomischen DNA (gDNA) aus Ohrbiopsien genotypisiert. Kurz gesagt, gDNA wurde aus Ohrbiopsien mit der Quick Extract DNA-Extraktionslösung (Lucigen) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten extrahiert. Die PCR wurde unter Verwendung der GO TAQ (R) Hot-Start-Polymerase (Promega, UK) durchgeführt, wobei Primer mit einer Endkonzentration von 1 µM verwendet wurden (Tabelle S2). Die Bedingungen bestanden aus einem anfänglichen 2-minütigen Denaturierungsschritt bei 95 °C, gefolgt von 30 Zyklen mit 94 °C für 45 s, 58 °C für 45 s, 72 °C für 45 s und einem abschließenden Verlängerungsschritt von 5 min bei 72 °C C. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf 1,5 %igen Agarosegelen in 1 × Tris-Acetat-EDTA (TAE) für 60 Minuten bei 80 V in Gegenwart von 100-bp-DNA-Markern (New England Biolabs, USA) analysiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 1 μl Midori-Grün-Direkt-DNA-Färbemittel (Geneflow, UK) zu 9 μl PCR-Produkt vor dem Auftragen auf das Gel gefärbt und unter UV-Licht mit einem Alphaimager abgebildet.

Die C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Mäuse wurden dann einzeln für 4 Wochen in Käfigen gehalten (Isolationszeitraum), um die Entwicklung der Darmmikrobiota entsprechend dem Genotyp von Mäusen zu ermöglichen, die aus denselben Zuchtpaaren stammten (Wurfgeschwister-Kontrolle). Stuhlproben wurden vor der Isolationszeit (~ 21 Tage nach der Geburt, als „Zeitpunkt 1“ bezeichnet) und nach der Isolationszeit (~ 75 Tage nach der Geburt, als „Zeitpunkt 2“ bezeichnet) entnommen. Als die Mäuse etwa 9 bis 10 Wochen alt waren, wurden sie durch Erhöhung der CO2-Konzentration getötet und nach Bestätigung des Todes durch Genickluxation wurden Gehirn, Blut, Blinddarminhalt und abgekratzter Schleim aus dem Dickdarm gesammelt und für nachfolgende Analysen aufbewahrt . C3GnT+/+ (n = 8) und C3GnT−/− (n = 8) Mäuse wurden auch für die Reihe von Verhaltenstests verwendet (Abb. S9).

DNA wurde aus Stuhlproben und abgekratztem Dickdarmschleim mit dem Fast DNA™ SPIN-Kit für die Boden-DNA-Extraktion (MP Biomedicals, USA) mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Das Gewicht des Fäkalienmaterials wurde in tarierten Röhrchen gemessen. Die Proben wurden in 978 μl Natriumphosphatpuffer (im Lieferumfang enthalten) resuspendiert, bevor sie nach Zugabe von 122 μl Lyselösung MT-Puffer 1 Stunde lang bei + 4 °C inkubiert wurden. Die Proben wurden dann in die Lyseröhrchen überführt und in einem FastPrep®-Instrument (MP Biomedicals) dreimal für 40 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0 m/s mit einem 5-minütigen Abstand auf Eis zwischen jedem Schritt des Perlenschlagens homogenisiert. Anschließend wurde das vom Lieferanten empfohlene Protokoll befolgt.

Nach der Extraktion der DNA aus Kotpellets und Schleim wurden die Konzentration und Qualität der DNA mit Qubit und Nanodrop bewertet. Die DNA wurde auf 5 ng/μL normalisiert und intern sequenziert. Die V3- und V4-16S-rDNA-Genregionen wurden unter Verwendung von Universalprimern amplifiziert. Für die erste PCR enthielt jede Vertiefung 4 μl kapa2G-Puffer, 0,4 μl dNTPs, 0,08 μl kapa2G-Polymerase, 0,4 μl 10 μM Vorwärtsschwanz-spezifischer Primer, 0,4 μL 10 μM Rückwärtsschwanz-spezifischer Primer, 13,72 μL PCR-Wasser und 1 μL normalisierte DNA . Die PCR-Bedingungen waren 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden mit einem letzten Schritt bei 72 °C für 5 Minuten. Anschließend wurde ein 0,7-facher SPRI mit KAPA Pure Beads (Roche, UK) durchgeführt und die DNA in 20 μl EB (10 mM Tris-HCl) eluiert.

Im Anschluss an die erste PCR wurde eine zweite PCR mit 5 μl des sauberen PCR-Produkts, 4 μl kapa2G-Puffer, 0,4 μl dNTPs, 0,08 μl kapa2G-Polymerase und je 2 μl der P7- und P5-Primer der Nextera XT Index Kit v2-Indexprimer durchgeführt ( Illumina-Katalog-Nr. FC-131-2001 bis 2004) wurden in jede Vertiefung gegeben. Schließlich wurden die 5 µL des sauberen spezifischen PCR-Mix hinzugefügt und gemischt. Die PCR wurde mit 95 °C für 5 Minuten, 10 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden durchgeführt, gefolgt von einem letzten Schritt bei 72 °C für 5 Minuten. Die erhaltenen Bibliotheken wurden dann mit dem Quant-iT dsDNA Assay Kit, High Sensitivity Kit (Fisher Scientific, UK) auf einem FLUOstar Optima Plattenlesegerät quantifiziert. Die Bibliotheken wurden nach der Quantifizierung in gleichen Mengen gepoolt. Der endgültige Pool wurde mit 0,7× SPRI unter Verwendung von KAPA Pure Beads gereinigt. Der endgültige Pool wurde auf einem Qubit 3.0-Gerät quantifiziert und auf einem High Sensitivity D1000 ScreenTape (Agilent) unter Verwendung der Agilent Tapestation 4200 laufen gelassen, um die endgültige Molarität des Bibliothekspools zu berechnen.

Der Pool wurde mit einer Endkonzentration von 8 pM auf einem Illumina MiSeq-Gerät unter Verwendung des MiSeq® Reagent Kit v3 (600 Zyklen, Illumina) gemäß den Denaturierungs- und Beladungsempfehlungen von Illumina betrieben, die einen 20 %igen PhiX-Spike in (PhiX Control v3 Illumina) beinhalteten. Die Rohdaten wurden lokal auf dem MiSeq mit dem MiSeq-Reporter analysiert.

Rohdaten, die durch Illumina MiSeq-Sequenzierung der 16S-Amplikons erzeugt wurden, wurden mit dem Dadaist2 0.8-Workflow CIT62 verarbeitet, wobei SeqFu 1.9 CIT63 verwendet wurde, um die Universalprimer zu entfernen, die zur Amplifikation der Zielregion verwendet wurden, und dann über DADA2 1.1664 verarbeitet, um die Amplikon-Sequenzvarianten zu identifizieren ( ASVs) und um eine Kontingenztabelle zu erstellen (mit der Rohhäufigkeit jedes ASV in jeder Probe). Das DECIPHER-Paket65 wurde verwendet, um jedem ASV, der mithilfe der SILVA 138-Datenbank66 identifiziert wurde, eine Taxonomie zuzuweisen, und die Ergebnisse wurden zur nachgelagerten Analyse in ein PhyloSeq CIT67-Objekt exportiert.

Dickdarmgewebe und Gehirn von Mäusen wurden geerntet und später bis zur RNA-Extraktion bei + 4 ° C in RNA gelagert. Anschließend wurden Proben (10–100 mg) in ein Röhrchen überführt, das 1 ml QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, UK) und 5 mm große Edelstahlkügelchen (Qiagen, UK) enthielt. Die Homogenisierung wurde mit dem FastPrep®-24 durch 2 intermittierende Läufe von 60 s bei einer Geschwindigkeit von 4,0 m/s im Abstand von 5 min bei Raumtemperatur erreicht. Die RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Reinigung der Gesamt-RNA aus tierischen Geweben durchgeführt. Die Elution wurde wie empfohlen mit 50 μl RNAse-freiem Wasser durchgeführt. Die Qualität und Konzentration der RNA-Proben wurde mit dem NanoDrop 2000-Spektrophotometer, dem Qubit RNA HS-Assay auf dem Qubit® 2.0-Fluorometer (Life Technologies, UK) oder dem Agilent RNA 600 Nano-Kit auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Stockport, UK) bewertet. . Nach der RNA-Extraktion wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von QuantiTect Reverse Transcriptase (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, einschließlich Kontrollen ohne Transkriptase zum Testen auf DNA-Kontamination (-RT-Kontrolle).

Für die quantitative Reverse-Transkription-PCR (RT-qPCR) wurden Reaktionen unter Verwendung der SYBR-Grün-Detektionstechnologie auf dem Roche Light Cycler 480 (Roche Life Science, UK) durchgeführt. Die Proben wurden nach dem Zufallsprinzip in 384 Mikrotiterplatten geladen und die Primer wurden ebenfalls in Dreifachansätzen randomisiert. Die Primersequenzen sind in Tabelle S3 angegeben.

Der Schleim wurde aus dem Dickdarm abgekratzt, in kaltem PBS resuspendiert und in Eis aufbewahrt. Die Lösung wurde dann 30 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert, um Bakterien (Pellet) und lösliche Proteine ​​(Überstand) zu trennen. Das Bakterienpellet wurde bis zur DNA-Extraktion bei –80 °C gelagert. Das Vorhandensein von Muc2 in der löslichen Fraktion wurde durch Slot-Blot unter Verwendung eines Anti-MUC2-Antikörpers bestätigt, nachdem die PVDF-Membran mit Pierce™ Protein-Free (PBS) Blocking Buffer (ThermoFisher) blockiert wurde. Der Überstand von Proben von 15 C3GnT+/+ und 12 C3GnT−/− wurde je nach Genotyp gepoolt und zur Muzinextraktion und -reinigung verarbeitet. Kurz gesagt wurde den Proben Cäsiumchlorid mit einer Enddichte von 1,4 g/ml zugesetzt und die Proben wurden bei 42.000 U/min auf einem Beckman Coulter 70 Ti-Rotor ultrazentrifugiert. Fraktionen (jeweils 1 ml) wurden gesammelt und diejenigen mit einer Dichte von mehr als 1,4 g/ml wurden zusammengegeben, gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Die gereinigten Mucine wurden unter reduktiven Bedingungen (0,1 M NaOH, 1 M Natriumborhydrid, NaBH4) 20 Stunden lang bei 45 °C einer β-Eliminierung unterzogen. Die Reaktion wurde durch langsame Zugabe von 5 Tropfen Eisessig (Sigma) gestoppt. Eine Entsalzungssäule wurde zusammengestellt, indem eine Paster-Pipette mit Glaswolle zur Steuerung des Flusses (Sigma) und Dowex 50 W × 8 Wasserstoffformkügelchen (Sigma) gepackt wurde. Nach der Elution der Entsalzungssäule mit 15 ml Eisessig wurden die Proben auf die Säule geladen. Die gesammelten Fraktionen wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet, um den Boratüberschuss zu verdampfen.

Die Permethylierung wurde an freigesetzten O-Glykanen aus Mucinproben durchgeführt. Die Proben wurden in 200 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) solubilisiert. Dann wurden der Suspension unter wasserfreien Bedingungen NaOH (1 Pellet) und 300 μl Jodmethan zugesetzt und die Proben 90 Minuten lang bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt. Die Permethylierungsreaktion wurde durch Zugabe von 1 ml Essigsäure (5 % Vol./Vol.) gestoppt. Permethylierte O-Glykane wurden in 1–2 ml Chloroform und 5 ml hochreinem Wasser extrahiert, gründlich durch Vortexen gemischt und 2 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert, damit die Mischung in zwei Schichten aushärten konnte. Der obere wässrige Teil (enthaltend DMSO) wurde entfernt und verworfen. Die untere Chloroformschicht wurde fünfmal mit MilliQ-Wasser (1 ml) gewaschen und dann unter Stickstoff unter Verwendung einer Verdampfereinheit getrocknet. Die getrockneten Proben wurden in 30 % Acetonitril in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure (TFA, Sigma) gelöst und 1:1 mit 20 mg/ml 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHBA) im gleichen Lösungsmittel gemischt. 2 μl wurden zur Analyse auf eine Zielplatte mit Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisation (MALDI) getupft.

MALDI-TOF- (Tandem-Flugzeit) und TOF/TOF-MS-Daten wurden mit dem Bruker Autoflex-Analysator-Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) im Positivionen- und Reflektronmodus erfasst. Die relative Quantifizierung der Sialylierung an Mucinen wurde auf der Grundlage der Summe aller Flächen von Massenpeaks, die sialylierten Strukturen entsprechen, dividiert durch die Summe aller Flächen von Massenpeaks, die definierten O-Glykanen entsprechen, berechnet. Eine ähnliche Berechnung wurde durchgeführt, um die relative Quantifizierung der Fucosylierung oder Sulfatierung an Mucinen zu bestimmen. Die Identifizierung von Glykanstrukturen wurde mit der Glycoworkbench-Software68 durchgeführt.

Um die Darmpermeabilität zu beurteilen, ließ man C3GnT+/+- und C3GnT-/--Mäuse 4 Stunden lang fasten, bevor ihnen 150 μl Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (FITC) (80 mg/ml 4 kD; Sigma-Aldrich) in sterilem 1× PBS oral verabreicht wurden Sonde. Die Mäuse wurden nach Schema 1 getötet, indem die CO2-Konzentration 4 Stunden nach der FITC-Behandlung erhöht wurde, und Blut wurde durch intrakardiale Punktion gesammelt. Die Blutproben wurden 1:4 in PBS verdünnt und die Konzentration des FITC-Dextrans mit einem Fluorimeter (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) mit einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm bestimmt. Zur Erstellung einer Standardkurve (von 8000 bis 0,125 ng/ml) wurde seriell verdünntes FITC-Dextran verwendet (Abb. S3).

Der Blinddarminhalt (100–200 mg) von C3GnT+/+ (n = 6) und C3GnT−/− (n = 6) Mäusen, das Gehirn (100–200 mg) von C3GnT+/+ (n = 9) und C3GnT− /− (n = 9) Mäuse und das aus C3GnT+/+ (n = 5) und C3GnT−/− (n = 5) Mäusen gepoolte Serum (50–60 µL) wurden von Metabolon, Inc, USA, verarbeitet und analysiert. Insgesamt wurden 705 Metaboliten im Gehirn, 911 im Blinddarminhalt und 945 im Serum nachgewiesen. Metaboliten wurden durch Vergleich mit Bibliothekseinträgen gereinigter Standards oder wiederkehrender unbekannter Einheiten identifiziert. Metabolon unterhält eine Bibliothek, die auf authentifizierten Standards basiert und die Retentionszeit/-index (RI), das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) und chromatographische Daten (einschließlich MS/MS-Spektraldaten) aller in der Bibliothek vorhandenen Moleküle enthält. Darüber hinaus basieren biochemische Identifizierungen auf drei Kriterien: Retentionsindex innerhalb eines engen RI-Fensters der vorgeschlagenen Identifizierung, genaue Massenübereinstimmung mit der Bibliothek ± 10 ppm und die MS/MS-Vorwärts- und Rückwärtswerte zwischen den experimentellen Daten und authentischen Standards. Die MS/MS-Scores basieren auf einem Vergleich der im experimentellen Spektrum vorhandenen Ionen mit den im Bibliotheksspektrum vorhandenen Ionen.

Nach der transkardialen Spülung mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS wurden die Gehirne der Mäuse extrahiert und über Nacht in PFA bei + 4 °C aufbewahrt. Als nächstes wurden die Gehirne in PBS gewaschen und durch Inkubation in einer aufsteigenden Alkoholreihe, beginnend bei 30–50–70–90 bis 100 % Ethanol, jeweils 1 Stunde lang dehydriert, gefolgt von einer Hydratisierung in abnehmenden Ethanolkonzentrationen von 100 auf 100 % 30 % und Verwendung von PBS im letzten Schritt. Die Gehirne wurden dann mit den Zwiebeln nach oben in 3 % Agar eingebettet und mit einem Vibratom (Leica, VT1200S) 60 µm dicke Scheiben geschnitten. Die schwimmenden Gehirnschnitte wurden dann mit einem Pinsel in eine Multiwellplatte (Corning, UK) übertragen. Für die Immunhistochemie wurden frei schwebende Schnitte entsprechend der interessierenden Region ausgewählt und folgten einem Maushirnatlas (Paxinos und Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact 5th Edition).

Gehirnschnitte (Bregma-Koordinaten von – 1,22 bis – 2,46 mm, einschließlich Hippocampus und Hypothalamus) wurden zunächst mit Antigen-Demaskierungspuffer (10 mM Citratpuffer, 0,05 % Tween 20, pH 6,0) 15 Minuten lang bei 70 °C vorgewärmt inkubiert 70 °C im Wasserbad. Die Schnitte wurden dann 2 Stunden lang mit einer PBS-Lösung, die 20 % normales Ziegenserum (NGS, Gibco) und 1 % Triton X100 enthielt, blockiert und dann über Nacht bei +4 °C mit Primärantikörpern (Tabelle S4) in einer Lösung mit 0,2 % NGS und 0,1 % Triton X100. Anschließend wurden die Schnitte fünfmal durch jeweils einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in 0,2 % NGS und 0,1 % Triton S4). Nach dem Waschen in PBS (6-mal, jeweils 30 Minuten Inkubation) wurden die Schnitte 5 Minuten lang mit 4ʹ,6-Diamidin-2-fenilindolo DAPI (1 µg/ml, Thermo Fisher, UK) gefärbt, gewaschen, montiert und abgedeckt. Mit Montagemedium (VECTASHIELD Antifade-Montagemedium-H100) überzogen.

Frisch extrahierte Gehirne von C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern wurden in die beiden Hemisphären getrennt, um Sagittalschnitte zu erhalten, und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert; Für die Gewebelyse wurde dann der freigelegte Hippocampusbereich mit einer Klinge aus der rechten und linken Hemisphäre herausgeschnitten, wodurch der Hippocampus und die umliegenden Regionen freigelegt wurden. Die Gewebeextrakte (15–20 mg) wurden in 500 µL Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 70 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml) homogenisiert Leupeptin, 2 % Triton X-100) wie beschrieben69. Lysate wurden 45 Minuten lang auf Eis mit 25 ng/µL Endosialidase behandelt. Die Proteine ​​wurden dann durch 4–12 % SDS-PAGE (50 µg Gesamtprotein pro Spur) aufgetrennt, gefolgt von Western Blot für 16 Stunden bei 4 °C. Die Membranen wurden mit 0,4 µg/ml des NCAM-spezifischen monoklonalen Ratten-Antikörpers (mAb) H28 und 1 µg/ml des polySia-spezifischen Maus-mAb 735 (IgG2a) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Herbert Hildebrandt) inkubiert. Zur Identifizierung von Tight-Junction-Proteinen wurden ZO-1-spezifische polyklonale Kaninchen-Antikörper (PABs) 1:1000 (Thermo Fischer Scientific) und Occludin-spezifische Maus-mAb 1:1000 (Thermo Fischer Scientific) verwendet. GAPDH wurde als Ladekontrolle unter Verwendung eines GAPDH-spezifischen PABs (Abcam) verwendet. Gebundene Antikörper wurden mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG (Vector Laboratories) nachgewiesen und durch verstärkte Chemilumineszenz unter Verwendung von Clarity Western ECL Substrate (BioRad) entwickelt. Die Quantifizierung wurde mit der ImageLab-Software (Bio-Rad) durchgeführt.

Die neuartige Objekterkennung (NOR), ein Maß für das Erkennungsgedächtnis, wurde wie zuvor beschrieben70,71 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, am ersten Tag wurden Mäuse (n = 8/Gruppe) in ein graues 50 × 50 × 50 cm großes Gerät eingewöhnt, das mit schwacher Lux-Beleuchtung (100 Lux) beleuchtet war, indem sie in das leere Labyrinth gestellt wurden und sich 10 Minuten lang frei bewegen konnten min kehrte dann zum Käfig zurück. Am zweiten Tag wurden die Mäuse wieder in das Labyrinth gesetzt und für einen Zeitraum von 10 Minuten an einen einzelnen Gegenstand konditioniert. Am dritten Tag wurden die Mäuse 15 Minuten lang in der gleichen Versuchsfläche in Gegenwart von zwei identischen Objekten untergebracht, danach wurden sie in ihre jeweiligen Käfige zurückgebracht und ein Intervall zwischen den Versuchen von 1 Stunde eingehalten. Eines der bekannten Objekte wurde durch ein neuartiges Objekt ersetzt. Die Mäuse wurden für die letzten 10 Minuten wieder in den Testbereich gesetzt. Videos wurden für einen Zeitraum von 5 Minuten analysiert. Wenn danach keine kumulative Gesamtzeit von 8 Sekunden in Gegenwart beider Objekte (vertraut und neu) erreicht wurde, wurde die Analyse für die gesamten 10 Minuten oder bis die Maus 8 Sekunden abgeschlossen hatte, fortgesetzt s Zeit, die in der Nähe des Objekts verbracht wird. Die Mäuse, die die erforderliche Zeit nicht erreichten, wurden von der Analyse ausgeschlossen72. Ein Diskriminierungsindex (DI) wurde wie folgt berechnet: DI = (TN − TF)/(TN + TF), wobei TN die Zeit ist, die für die Erkundung des neuen Objekts aufgewendet wurde, und TF die Zeit ist, die für die Erkundung des vertrauten Objekts aufgewendet wurde.

Der Y-Labyrinth-Spontanwechseltest, ein Maß für das räumliche Arbeitsgedächtnis, wurde am letzten Tag des Verhaltenstests durchgeführt, wie zuvor beschrieben73. Kurz gesagt, der Y-Labyrinth-Apparat aus weißem Plexiglas mit drei verschiedenen Armen (Abmessungen 38,5 × 8 × 13 cm, jeder Arm in einem Winkel von 120° zueinander) wurde mit einer Beleuchtung mit geringer Lux (100 lx) beleuchtet. Die zu testende Maus wurde in das Labyrinth gesetzt und durfte sich 7 Minuten lang frei erkunden, während eine Software den Zonenübergang und die Bewegungsaktivität aufzeichnete (Ethovision XT, Noldus, UK). Es wird erwartet, dass die Maus ihrem natürlichen Erkundungsinstinkt folgt, durch das Labyrinth geht und jeden Arm gleichermaßen besucht.

Der Open-Field-Test (OFT) wurde wie zuvor beschrieben74 durchgeführt. Kurz gesagt wurde die zu testende Maus in der Mitte des OFT platziert und ein Video-Tracking-System (Ethovision XT, Noldus, UK) zeichnete die Gesamtstrecke auf, die die Mäuse zurückgelegt hatten, sowie die Zeit, die sie in der Mitte des Feldes verbrachten innerhalb der ersten 5 Min. Das Freilandlabyrinth wurde zwischen jeder Maus mit 20 %igem Ethanol gereinigt, um Gerüche zu beseitigen. Es wird erwartet, dass die Maus die Kiste erkundet und dabei in der Nähe von Wänden bleibt (Thigmotaxis)42.

Alle statistischen Analysen wurden mit der R-Version 4.1.0 durchgeführt. Bei der Glykananalyse aus Darmschleimen wurden für jede Fraktion mindestens drei technische Replikate durchgeführt und für jede Fraktion wurden t-Tests zum Vergleich zwischen C3GnT+/+- und C3GnT−/−-Wurfgeschwistern verwendet.

Bei der Analyse der Darmmikrobiota wurden 16S-Daten so gefiltert, dass nur ASVs mit einer Anzahl von mehr als 3 in mindestens 20 % der Proben einbezogen wurden. Anschließend wurden ASVs zur Primäranalyse in Familien zusammengefasst. Die relativen Häufigkeiten und zentrierten logarithmischen Verhältnisse jeder Familie wurden nach Genotyp mit Mittelwerten und Konfidenzintervallen aufgezeichnet.

Die Bray-Curtis-Distanzmatrix wurde auf der Grundlage der skalierten Gesamtsummendaten berechnet und die mehrdimensionale Skalierungs-Ordination (MDS) wurde in Schichten aufgetragen, die dem Probenpunkt (Zeitpunkt 1 vs. Zeitpunkt 2) entsprachen. PERMANOVA wurde mit Adonis2 aus dem veganen R-Paket durchgeführt. Für die Differentialhäufigkeitsanalyse wurden zwei Ansätze verwendet. Zunächst wurde DESeq2 auf die Zähldaten (auf Familienebene aggregiert) separat für Stuhlproben (Zeitpunkt 2) und unabhängig voneinander abgekratzten Schleim angewendet, um die Familienzahlen über Genotypen hinweg zu vergleichen. Alle DESeq2-Standardwerte wurden akzeptiert, einschließlich der Benjamini-Hochberg-Korrektur der p-Werte.

Zweitens wurden standardmäßige lineare Regressionsmodelle auf Centered-Log-Verhältnisse angewendet, die mithilfe des Mikrobiompakets in R berechnet wurden. Die Analysen wurden auch für drei andere Datensätze wiederholt: (1) alle ASVs, (2) die 20 besten ASVs nur in Familien zusammengefasst, (3) Auf Stammebene aggregierte Daten.

Unterschiede in der Genexpression zwischen den Gruppen wurden berechnet, indem die Auswirkung des Genotyps auf die Ct-Werte abgeschätzt und die Ct-Werte beider Haushaltsgene (Gapdh und Tbp) berücksichtigt wurden, wobei einzelne Mäuse als Zufallseffekt einbezogen und die Replikation als fester Effekt berücksichtigt wurden. Die Daten von drei Proben wurden vor der Analyse als Ausreißer aufgrund einer visuellen Inspektion der Ct-Werte entfernt. Die Daten werden als geschätztes Verhältnis der Genexpression (C3GnT−/− vs. C3GnT+/+) mit 95 %-Konfidenzintervallen für jedes Gen dargestellt. Die P-Werte wurden mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode unter Berücksichtigung von vierzehn gleichzeitig getesteten Genen angepasst.

Eine Schätzung der Falscherkennungsrate (q-Wert) wurde berechnet, um die mehrfachen Vergleiche zu berücksichtigen, die normalerweise in metabolomischen Studien auftreten. Der q-Wert beschreibt die Falscherkennungsrate; Ein niedriger q-Wert (q < 0,10) ist ein Hinweis auf hohes Vertrauen in ein Ergebnis.

In der Verhaltensstudie wurden die Daten mit der Software „Origin 9“ (OriginLab, Northampton, USA) analysiert. Für die Bewertung von Verhaltenstests bei Mäusen wurden ungepaarte t-Tests mit Normalitätsprüfungen von QQ-Plots verwendet. Ausreißer wurden durch den ROUT- oder Grubbs-Test erkannt.

Die Autoren bestätigen, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Artikel und seinen ergänzenden Materialien verfügbar sind. Die für die Metabarcoding-Analyse dieses Projekts erstellten Rohdaten sind bei der EBI ENA unter der Projektzugangs-ID PRJEB57587 und der Studien-ID ERP142578 verfügbar. Die Metabolomics-Daten werden dem entsprechenden Autor auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

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Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC); Diese Forschung wurde vom BBSRC Institute Strategic Program Grant Gut Microbes and Health BB/R012490/1 und seinen Teilprojekten BBS/E/F/000PR10353 (Thema 1, Determinanten der Mikroben-Wirts-Reaktionen im Darm über das gesamte Leben) und EC finanziert ein BBSRC Norwich Research Park Doctoral Training Grant BB/M011216/1. GS und AT wurden durch den BBSRC Core Capability Grant BB/CCG1860/1 unterstützt. Die Autoren danken Mohammad K. Hajihosseini für den Zugang zum Vibratom und Herbert Hildebrandt für die Antikörper und Reagenzien zum Nachweis von PSA-NCAM mittels Western-Blot-Analyse. Die bioinformatischen Analysen wurden mit der vom MRC CLIMB BIG DATA Grant MR/T030062/1 bereitgestellten Rechenkapazität durchgeführt.

Strategisches Programm des Darm Microbes and Health Institute, Quadram Institute Bioscience, Norwich, NR4 7UQ, Großbritannien

Erika Coletto, George M. Savva, Dimitrios Latousakis, Emmanuelle H. Crost, Laura Vaux, Andrea Telatin und Nathalie Judge

Norwich Medical School, Biomedizinisches Forschungszentrum, University of East Anglia, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7TJ, Großbritannien

Matthew Pontifex & David Vauzour

Fachbereich Biologie, University of British Columbia, Okanagan Campus, 3333 University Way, Kelowna, BC, V1V 1V7, Kanada

Kirk Bergstrom

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NJ überwachte die Arbeit und koordinierte die Erstellung des Manuskripts. EC führte die meisten Mausexperimente und nachgelagerten Analysen durch. DL führte Mucin-Glykosylierungsanalysen durch. AT analysierte die Rohdaten der 16S-rDNA-Sequenzierung. GMS führte bioinformatische und statistische Analysen durch. MP und DV führten Verhaltenstests und -analysen bei Mäusen durch. LV und EHC unterstützten bei Mausexperimenten, Probenentnahme und -verarbeitung. KB hat das Mausmodell erstellt und das Manuskript überprüft. NJ und EC haben das Manuskript mit Beiträgen von GMS, DL, MP und DV verfasst und überprüft

Korrespondenz mit Nathalie Juge.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Coletto, E., Savva, GM, Latousakis, D. et al. Rolle der Mucin-Glykosylierung in der Darmmikrobiota-Hirn-Achse von Mäusen mit Core-3-O-Glykan-Mangel. Sci Rep 13, 13982 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40497-8

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Eingegangen: 3. März 2023

Angenommen: 11. August 2023

Veröffentlicht: 26. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40497-8

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